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發布時間: 2017 - 07 - 18
Drop Maker 樣本制備儀采用光、機、電一體化設計,配套具有自主知識產權的微流控芯片,可以將水相樣本快速制備成納升體積的液滴。液滴數與樣本體積相關,30微升樣本可制備約5萬個液滴。液滴尺寸均一,并可在PCR擴增后保持穩定。產品說明起始樣本量(μL)20-50制備通量1-8個樣本制備時間4min / 8樣本每 30 μL 樣本液滴數約50000個儀器尺寸(寬 ´ 深 ´ 高)38 x 34 x 35 cm
發布時間: 2017 - 07 - 18
Chip Reader 生物芯片分析儀采用光、機、電一體化設計,及激光共聚焦原理,配套有自主知識產權的微流控芯片,可以準確快速地定位、識別納升體積微液滴,獲取其熒光信號值。經過泊松統計分析,提供研究者所需的陽性、陰性液滴數絕對數值,從而推算出起始靶標核酸分子的精確濃度。Chip Reader  生物芯片分析儀兼容Taqman水解探針和EVAGreen檢測。產品說明閱讀通道FAM(EvaGreen)、VIC(HEX)閱讀通量1-8個樣本閱讀時間20min / 8樣本儀器尺寸(寬 ´ 深 ´ 高)45 x 47 x 49 cm
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數字PCR在二代測序質控中的應用

日期: 2020-04-01
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數字PCR在二代測序質控中的應用


基因檢測的主要方法包括聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)、一代測序(Sanger測序)、熒光原位雜交(FISH)、高通量測序(next generation sequencing, NGS)等。NGS可以一次性檢測多個基因、全外顯子甚至全基因組區域的所有位點,通量高,在多基因檢測中具有優勢。但NGS的開展需要專業的知識和技術團隊,這是實現NGS檢測臨床應用價值的前提。除了少數腫瘤小panel NGS檢測產品獲得醫療器械證書,目前我國和其他國家各實驗室所使用的NGS檢測多為實驗室自建試驗(laboratory-developed test, LDT)。這表明NGS檢測在臨床應用中具有較大的靈活性,但同時表明NGS檢測臨床應用具有較大的風險性,這給NGS檢測實驗室的管理、人員培訓和質量控制(包括檢測實驗和生物學信息分析)等都帶來很大的壓力。因此,通過其他技術平臺和方法對NGS檢測過程及檢測結果進行有效質控非常重要。數字PCR技術是NGS平臺質控的一個有力工具,在NGS測序文庫精確定量和結果驗證等方面具有廣泛應用?!抖鷾y序技術在血液腫瘤中的應用中國專家共識》(2018年版)中就明確規定,對于可疑結果,需要進行人工校對,并采用Sanger測序、ARMS-PCR、數字PCR等方法進行驗證。


NGS在測序過程中,由于試劑差異、人員操作、儀器維護等因素,實際的捕獲效率和覆蓋度會與期望值存在偏差,可能會捕獲到非目標區域序列,也可能漏捕目標區域序列。非目標區域序列對于靶向測序沒有意義,而脫靶序列會導致測序信息缺失。因此,對于任何檢測項目,每一次測序必須給出靶向區域的覆蓋度統計,這是衡量測序質量的重要指標之一。當覆蓋度過低時,則需補測數據或對樣本重測,同時對可疑數據用數字PCR等方法進行驗證。


新羿TD-1數字PCR平臺在NGS測序結果驗證和質控中均有廣泛的應用,其操作步驟簡單,結果準確可靠。

數字PCR在二代測序質控中的作用

新羿TD-1數字PCR平臺基因檢測流程


案例一:某公司在用NGS進行腫瘤突變基因檢測時,使用兩個panel進行檢測,測序結果PIK3CA基因突變一個panel檢測的突變率為16%,另一個panel檢測的突變率為30%,二者差異較大,通過數字PCR驗證后,突變率為16%,進一步確認了其中一個panel的準確性。該現象可能是由測序錯誤、比對錯誤等原因導致的, 從而造成得到的突變頻率可能會存在較大偏移。而非真實的突變頻率會對腫瘤異質性、克隆演化等研究數據產生重要影響。


案例二:第三方檢驗所在進行室間質評項目評估時,用NGS檢測室間質評樣本時,對于低于1%的樣本不確定是否是真正的陽性樣本,需要通過數字PCR進行驗證,數字PCR檢測結果為0.4%,則確認該樣本為陽性樣本。因此,目前NGS商業報告通常按2%報告結果,一般1%也可以確定,但最好對5%或2%以下的樣本通過數字PCR進行驗證,可以進一步保證結果準確性。


案例三:某測序公司在建立新項目時,使用NGS參考品對panel進行驗證,其中EGFR基因20外顯子插入突變未報陽性結果,與參考品理論值不符合,用數字PCR對參考品進行檢測后,發現20外顯子插入突變為陽性,突變率為50%,驗證參考品沒問題,進一步對數據分析流程進行人工校正,最終發現是算法出現問題,后修正算法,解決了20外顯子插入突變的檢測問題。



綜上所述,在實際臨床應用中, 我們必須掌握NGS技術中生物學數據質量控制的重要質控環節和影響因素,進行測序結果驗證, 只有通過驗證過程才能找到最適合檢測項目的最優分析方案,包括軟件的選擇和參數的設置,從而使NGS成為臨床檢測和科學研究的一個成熟檢測平臺。

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