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發布時間: 2017 - 07 - 18
Drop Maker 樣本制備儀采用光、機、電一體化設計,配套具有自主知識產權的微流控芯片,可以將水相樣本快速制備成納升體積的液滴。液滴數與樣本體積相關,30微升樣本可制備約5萬個液滴。液滴尺寸均一,并可在PCR擴增后保持穩定。產品說明起始樣本量(μL)20-50制備通量1-8個樣本制備時間4min / 8樣本每 30 μL 樣本液滴數約50000個儀器尺寸(寬 ´ 深 ´ 高)38 x 34 x 35 cm
發布時間: 2017 - 07 - 18
Chip Reader 生物芯片分析儀采用光、機、電一體化設計,及激光共聚焦原理,配套有自主知識產權的微流控芯片,可以準確快速地定位、識別納升體積微液滴,獲取其熒光信號值。經過泊松統計分析,提供研究者所需的陽性、陰性液滴數絕對數值,從而推算出起始靶標核酸分子的精確濃度。Chip Reader  生物芯片分析儀兼容Taqman水解探針和EVAGreen檢測。產品說明閱讀通道FAM(EvaGreen)、VIC(HEX)閱讀通量1-8個樣本閱讀時間20min / 8樣本儀器尺寸(寬 ´ 深 ´ 高)45 x 47 x 49 cm
發布時間: 2020 - 03 - 13
該試劑盒采用創新的RNA一步法逆轉錄數字PCR技術,可對樣本中的2019-nCoV進行高靈敏與準確定量檢測。參考國家CDC和WHO的指南,針對2019-nCoV的多個區域進行檢測,增加檢測的特異性并減少漏檢錯檢。試劑盒內設有內參基因,可對采樣、提取和PCR擴增等步驟進行質控,確保檢測過程的精準可靠。該試劑盒目前已經在多家新型冠狀病毒治療重點醫院或國家重點實驗室開展臨床評價,目前的評估數據顯示有非常優異的性能。
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數字PCR在ALK融合基因檢測中的應用

日期: 2020-03-27
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數字PCR在ALK融合基因檢測中的應用


肺癌是世界上最常見的的惡性腫瘤之一,每年全球發病人數已經超過160萬,分為非小細胞肺癌(non small cell carcinoma,NSCLC)和小細胞肺癌(small cell carcinoma,SCLC),其中前者約占80%。超過一半的非小細胞肺癌患者在被發現時已經是晚期,無法進行手術治療,以往只能采用鉑類藥物進行化療,療效差,且毒副作用大。隨著分子診斷技術的發展,精準醫療時代已經來臨,EGFR、ALK、ROS1、KRAS等作為肺癌驅動基因被發現,美國國立綜合癌癥網絡 (National Comprehensive Cancer Network, NCCN) 指南中建議對NSCLC患者進行多種與NSCLC高度相關的驅動基因的并行檢測,制定安全有效的個性化治療方案。


表皮生長因子 (epidermal growth factor receptor, EGFR) 是NSCLC中最常見的驅動基因,常見的與其相關的靶向藥物有酪氨酸酶抑制劑類藥物厄洛替尼、吉非替尼、阿法替尼及奧希替尼等。ALK (anaplastic lymphoma kinase, ALK) 融合基因是NSCLC中第二常見的驅動基因,ALK編碼酪氨酸激酶受體蛋白,屬于胰島素受體超家族,除了腦組織之外,表達量自出生后下降至低水平,在正常的肺組織中并不表達,其3'端酪氨酸激酶區可與多種伴侶發生融合,使ALK基因的3'端實現了高表達(圖1)1。

數字PCR在ALK融合基因檢測中的應用

圖1. ALK融合基因野生型和突變型的

5'和3'端擴增實驗1


最常見的融合伴侶是棘皮動物微管相關類蛋白4 (echinoderm microtubule-associated protein-like 4, EML4),EML4-ALK融合基因于2007年由日本學者Soda2發現并證實其為肺癌驅動基因(圖2),EML4氨基末端螺旋結構域可促進ALK同源二聚體的形成與活化,引起PI3K-AKT、RAS-MAPK和JAT-ATAT信號通路的活化,進而導致腫瘤細胞異常增殖分化并抑制凋亡。EML4和ALK兩個基因分別位于人類2號染色體的p21和p23上,根據其斷裂位點的不同可分為多種突變型,其中以V1 (A20;E13) 和V3a/b (A20;E6a/b)突變型最為常見。除了EML4之外,亦有多種其他罕見的融合伴侶,如KIF5B、TFG、HIP1、KLC1等。針對腫瘤誘發機制的酪氨酸激酶抑制劑類的一代靶向藥物克唑替尼、二代靶向藥物艾樂替尼、色瑞替尼、Brigatinib和三代靶向藥物Loratinib等靶向藥物已經問世,為眾多的NSCLC患者帶來了福音,減輕了患者的痛苦,但所有患者在服用靶向藥物1年內都會出現耐藥現象,最容易出現中樞神經系統轉移現象。耐藥機制復雜多變,包括ALK激酶區域的C1156Y、L1196M、G1269A、G1202R、S1206Y、I1171T等二次突變、ALK融合基因拷貝數的擴增、信號旁路的激活等3。近幾年,有若干學者對EML4-ALK的不同突變型及不同的融合伴侶進行了靶向藥物的敏感性及耐藥性研究,發現其會影響靶向藥物的療效,EML4-ALK不同變體會導致不同的蛋白質結構穩定性及對ALK抑制劑的敏感性,一些罕見的融合伴侶的療效要優于EML4-ALK,而一些罕見的融合伴侶會發生原發性耐藥4,如DTNB-ALK、NR_110271-ALK、ZC3H8-ALK和STED2-ALK。隨著更多的靶向藥物的出現及臨床試驗的開展,更多融合基因的療效規律將會被證實,與之相關的藥物靶點的精準檢測成為當務之急。

數字PCR在ALK融合基因檢測中的應用

圖2. EML4-ALK肺癌驅動基因研究實驗2


傳統的ALK融合基因的檢測方法有熒光原位雜交法(FISH)、免疫組織化學法(IHC)、逆轉錄熒光PCR法(RT-PCR)。隨著分子診斷技術的發展,近年來高通量測序(NGS)和數字PCR(dPCR)技術逐漸被應用到臨床的分子檢測。五種方法的優劣勢比較如下表:

數字PCR在ALK融合基因檢測中的應用

Qiushi Wang等人5使用FISH和數字PCR對103名肺癌患者的FFPE樣本進行檢測,FISH檢測出14例陽性患者,其中13例經數字PCR檢測為陽性,數字PCR漏檢的1例,經靶向測序確定為KIF5B-ALK融合基因,數字PCR引物未覆蓋。同時,數字PCR另外發現16例ALK融合基因低拷貝樣本,這16例標本因檢測值小于FISH的陽性cutoff值(腫瘤細胞占比15%)而被確定為陰性。16例ALK融合低拷貝的患者中,有兩例患者在化療失敗后接受了克唑替尼治療,一例患者(ALK融合比例10%)部分緩解,PFS為7個月;另一例患者(ALK融合比例8%)疾病穩定,PFS為5個月。通過這個研究,數字PCR充分體現了其高靈敏度和絕對定量的優勢。吳一龍教授曾發現EGFR突變豐度與EGFR TKI療效相關,在ALK融合突變中,可能也存在同樣的規律。但突變豐度與療效的閾值定在多少,目前并沒有統一的共識,其中一個重要原因是以前方法的定量能力不足,而數字PCR有望彌補這一不足。


綜上所述,數字PCR技術靈敏度高、特異性強、重復性好、可絕對定量的優點,在ALK等腫瘤基因的臨床檢測中有廣闊的應用前景,可以對患者的腫瘤發生、發展全過程進行動態監測,確定最佳的治療方案,實現臨床全過程的“精準醫療”。


新羿生物專注于微液滴數字PCR全鏈條自主研發,包括芯片、儀器、試劑、軟件等核心產品,目前已申請專利50余項,開發產品數十項。新羿生物的試劑類產品不僅可以在新羿TD-1數字PCR平臺上使用,而且可以在其他商用微液滴數字PCR平臺上使用,靈敏度高,特異性好,重復性高。新羿生物的微流控芯片數字PCR技術在檢測過程中全程封閉檢測,不需轉移液滴,可避免交叉污染,方便、準確、靈敏。


新羿ALK融合基因檢測試劑盒采用RT-ddPCR技術,以非小細胞肺癌(NSCLC)樣本RNA為檢測對象,對NSCLC中存在的多種ALK基因融合類型同時進行檢測,從而輔助臨床更全面選擇出可受益于克唑替尼的NSCLC患者。適用于NSCLC患者在進入靶向治療之前使用,為腫瘤患者個體用藥提供科學依據。試劑盒可對ALK基因常見融合位點進行準確檢測,檢測靈敏度達到0.1-1ng RNA,檢測結果如下圖所示。

數字PCR在ALK融合基因檢測中的應用

圖3. 新羿ALK融合基因檢測試劑盒檢測結果



參考文獻:

1. Rui Wang,?et al.?“The Use?of Quantitative Real-Time Reverse Transcriptase PCR for 5’ and 3’ Portions of ALK Transcripts to Detect ALK Rearrangements in Lung Cancers”.?Clinical Cancer Research.?2012;? 18(17):?4725-6079.

2. Manabu Soda, et al.?“Identification of the Transforming EML4-ALK Fusion Gene in Non-small-cell Lung Cancer”.?Nature.? 2007;?448 (7153):?561-566.

3. Kathryn C. Arbour,?et al.?“Diagnosis and Treatment of ALK Positive NSCLC”.Hematolgy?Oncology Clinics of North America.?2017; 31(1): 101-111.

4. Jin?Kang,?et al.?“Uncommon ALK Fusion Partners in Advanced ALK-positive Non-small-cell Lung Cancer”.?Journal of Clinical?Oncology.?2018; http://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/ JCO.2018.36.15_suppl.8561.

5. Qiushi Wang,?et al.?”Droplet Digital PCR for Absolute Quantification? of? EML4-ALK Gene Rearrangement in Lung Adenocarcinoma”.?The Journal of Molecular Diagnostics.?2015; 5(17): 515-520.



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